肺部含有多種巨噬細胞和樹突狀細胞群體，它們在肺部疾病中起著關(guān)鍵作用。準確識別和計數(shù)這些亞群對于理解它們在肺部疾病中的作用至關(guān)重要。流式細胞術(shù)是研究免疫系統(tǒng)的主流工具。然而，尚未有系統(tǒng)的流式細胞學方法能夠在正常小鼠肺中準確且一致地識別巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）亞群。在本研究中，我們開發(fā)了一套表面標志物Panel和分析策略，能夠準確識別肺中穩(wěn)態(tài)條件下所有已知巨噬細胞和樹突狀細胞群體及其前體細胞。

肺臟包含多種固有免疫細胞：

肺臟樣品制備：

肺組織處理：

• 經(jīng)右心室灌注PBS后，剪碎肺組織，用膠原酶D（1 mg/mL）和DNA酶I（0.1 mg/mL）消化。

• 過40 μm尼龍篩，制備單細胞懸液，裂解紅細胞。

• 臺盼藍染色排除死細胞，用細胞計數(shù)儀計數(shù)。

肺臟穩(wěn)態(tài)條件下圈門策略：

圈門步驟：

表面Marker：

• 單核/未分化巨噬細胞：CD11b? CD11c^(±) MHC II? CD64^(low) Ly6C^(hi/lo)

為驗證準確性，對各群細胞進行了分選并做細胞涂片（Diff-Quik染色）：

• AM：偽足明顯，胞質(zhì)含空泡

• DC和IM：核不規(guī)則，胞質(zhì)多空泡

肺泡巨噬細胞自發(fā)熒光強，易導致假陽性，本組合通過多參數(shù)交叉驗證避免誤判，克服了自發(fā)熒光干擾。CD11b? DC vs 間質(zhì)巨噬細胞，區(qū)別的關(guān)鍵在于 CD64? vs CD24?，區(qū)分易混細胞群體。相比之下，傳統(tǒng)“CD11b vs CD11c"雙參數(shù)設(shè)門法無法區(qū)分CD11b? DC、間質(zhì)巨噬細胞和未成熟單核細胞，且易將中性粒/嗜酸粒誤判為單核細胞。因此，這篇文獻，系統(tǒng)的給小鼠肺臟巨噬細胞和DC細胞文獻參考圈門解決方案。

原始文獻：

Misharin AV, Morales-Nebreda L, Mutlu GM, Budinger GR, Perlman H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013;49(4):503-510. doi:10.1165/rcmb.2013-0086MA