巨噬細胞是造血系統中*可塑性的細胞，存在于所有組織中，具有豐富的功能多樣性。巨噬細胞參與細胞碎片和病原體的識別、吞噬和降解，并且在向T細胞提呈抗原以及誘導其他抗原呈遞細胞表達共刺激分子等方面發揮作用，從而啟動適應性免疫反應。

除此之外，巨噬細胞還在維持組織穩態以及組織的修復和重塑方面發揮作用。當遇到不同的抗原刺激時，單核細胞會變成高度殺傷性的巨噬細胞（M1），或變成免疫抑制性的巨噬細胞（M2）。

實驗前準備

一、THP-1細胞的極化

1) THP-1細胞鋪板，將佛波酯PMA（100 ng/ml）加入*培養基中，誘導其向巨噬細胞的成熟；

2) 48小時后THP-1細胞成熟為巨噬細胞，外觀圓形高折光，從懸浮狀態快速變成貼壁狀態；

3) 將成熟的巨噬細胞消化下來（Accutase酶消化：專門用于消化貼壁細胞），重新鋪板，誘導向M1-like、M2-like的極化。

4) 與IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(100 ng/ml)孵育48小時以上，使其向M1極化。

與IL-4(20 ng/ml)和IL-13(20 ng/ml)孵育48小時以上，使其向M2極化。

5) 極化完成后，細胞用不含刺激物的無血清RPMI重懸，可保持72小時。

二、單核細胞來源巨噬MDM

1) 將單核細胞以5×105/ml的濃度接種在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，同時加入20 nM的CSF-1。

2) 單個核細胞在37°C、5% CO2條件下培養7天，每3天更換一次培養液，獲得MDM。

3) MDM得到之后，去除原培養基，更換新的培養基。

4) 若與新鮮的、無血清的RPMI繼續培養，則維持M0狀態。

5) 與LPS(1 μg/ml)和IFN-γ(10 ng/ml)孵育48小時，則向M1極化。

與IL-4(20 ng/ml)和IL-13(5 ng/ml)孵育48小時，則向M2表型極化。

6) 極化完成后，細胞用不含刺激物的無血清RPMI重懸，可保持72小時。

三、骨髓來源巨噬細胞BMDM

1) 將分離的骨髓細胞以2×106/ml的濃度接種在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的IMDM培養基中，同時加入10 ng/ml M-CSF。

2) 在第3天更換新鮮的BMDM生長培養基。

3) 第7天，熒光團偶聯抗體染色，用流式細胞術檢測表達CD11b和F4/80的細胞來評估成熟BMDM的形成。

4) 第7天，成熟BMDM的形成后改為新鮮刺激培養基。

5) 與100 ng/ml LPS或含有50 ng/ml IFNγ的100 ng/ml LPS共孵育，則向M1極化。

與10 ng/ml IL-4和/或10 ng/ml IL-13共孵育，則向M2極化。

6) 用0.05%的胰蛋白酶將受刺激的細胞從培養皿中分離出來，然后用含有10%胎牛血清的PBS洗滌細胞兩次。

四、RAW264.7細胞極化

1) 將RAW264.7細胞重懸在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中。

2) 將傳至2-5代的細胞作為后續實驗使用。

3) 并將培養基換成不含胎牛血清的*培養基。

4) 與100 ng/ml LPS共孵育，則向M1極化。

與20 ng/ml IL-4（可添加20 ng/ml IL-10）共孵育，則向M2極化。

下表為對以上4種細胞誘導試劑進行的簡要匯總

參考文獻：

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